Construction of Genomic DNA Library of Bacillus amyloliquefaciens KKU14 Harboring Antimicrobial Activities Against Burkholderia pseudomallei
Keywords:
Antimicrobial peptide, Fosmid library, Bacillus amyloliquefaciens, Burkholderia pseudomalleiAbstract
การสร้างฐานข้อมูลพันธุกรรมของ Bacillus amyloliquefaciens KKU14 ที่สร้างสารต้าน Burkholderia pseudomallei
วจีอร อ้วนชารี1, 3, โชติมา โพธิทรัพย์ 1, 3, รศนา เสริมสวรรค์1, 3, อัชฌา บุญมี2, 3
1ภาควิชาชีวเคมี คณะแพทยศาสตร์ มหาวิทยาลัยขอนแก่น
2ภาควิชาจุลชีววิทยา คณะวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยขอนแก่น
3ศูนย์วิจัยโรคเมลิออยโดสิส มหาวิทยาลัยขอนแก่น
หลักการและวัตถุประสงค์: โรคเมลิออยด์เป็นโรคติดเชื้อ เกิดจากแบคทีเรีย Burkholderia pseudomallei ซึ่งเป็นเชื้อที่มีอัตราการดื้อยาปฏิชีวนะหลักสูงมาก จึงจำเป็นต้องค้นหายาชนิดใหม่ที่มีประสิทธิภาพสูงขึ้น การศึกษาก่อนหน้านี้พบว่าแบคทีเรีย B. amyloliquefaciens KKU14 สามารถสร้างสารเปปไทด์ต้านจุลชีพซึ่งยับยั้งเชื้อ B. pseudomallei ได้หลายสายพันธุ์ การศึกษานี้มีวัตถุประสงค์เพื่อหายีนที่สร้างสารเปปไทด์ต้านจุลชีพยับยั้งเชื้อ B. pseudomallei โดยการสร้างฐานข้อมูลพันธุกรรมของ B. amyloliquefaciens KKU14 ซึ่งจะเป็นประโยชน์ในการศึกษาคุณสมบัติของสารในการยับยั้งเชื้อต่อไป
วิธีการศึกษา: สร้างฐานข้อมูลพันธุกรรมของ B. amyloliquefaciens KKU14 โดยใช้เวกเตอร์ pCC2FOS ทำการคัดเลือกหาโคลนที่มีฤทธิ์ต้าน B. pseudomallei ด้วยวีธี solf agar overlay และ agar well diffusion
ผลการศึกษา: ได้สร้างฐานข้อมูลพันธุกรรมของ B. amyloliquefaciens KKU14 สำเร็จ โดยชิ้นแทรกดีเอ็นเอมีขนาดประมาณ 30-40 กิโลเบส จากการคัดเลือกเบื้องต้นด้วยวิธี solf agar overlay พบว่ามีโคลนที่สามารถยับยั้ง B. pseudomallei สายพันธุ์ P37 ได้ 5 โคลน แต่เมื่อทดสอบด้วย agar well diffusion พบว่ามี 1 โคลนที่สามารถยับยั้ง B. pseudomallei ได้
สรุป: การสร้างฐานข้อมูลพันธุกรรมของ B. amyloliquefaciens KKU14 และแสดงออกใน E. coli พบโคลนที่ออกฤทธิ์ต้าน B. pseudomallei สายพันธุ์ P37 ซึ่งจะมีการวิเคราะห์หาลำดับเบสของดีเอ็นเอเพื่อบ่งชี้ยีนที่เกี่ยวข้องต่อไป
Background and Objective: Melioidosis is a serious community-acquired infectious disease caused by a Gram-negative bacterium Burkholderia pseudomallei. Several strains are highly resistant to almost all available antibiotic drugs, so the discovery of novel potential drugs becomes strictly necessary. Previous study indicated that antimicrobial peptides (AMPs) produced by Bacillus amyloliquefaciens KKU14 showed a broad spectrum of activity to strongly inhibit B. pseudomallei. In this study, genes encoding AMP against B. pseudomallei from the genome of B. amyloliquefaciens KKU14 were investigated through genomic DNA library. The identified AMP genes can be further characterized.
Materials and Methods: The genomic DNA library of B. amyloliquefaciens KKU14 was constructed by using pCC2FOS vector. The library clones were overlaid by soft agar containing B. pseudomallei strain P37. The clones with clear zones were confirmed by agar well diffusion method.
Results: Genomic libraries of B. amyloliquefaciens KKU14 were successfully constructed. Five recombinant clones with approximately 30-40 kb genome fragments exhibited antimicrobial activities against B. pseudomallei strain P37 as observed by soft agar overlay assay. In agar well diffusion test, culture supernatant from one clone showed antimicrobial activities against B. pseudomallei strain P37.
Conclusion: A recombinant clone from B. amyloliquefaciens KKU14 genome showed antimicrobial activities inhibiting B.pseudomallei strain P37. DNA sequencing and data analysis will be proceeded to identify the involving genes.
References
Chaowagul W. Recent advances in the treatment of severe melioidosis. Acta Trop 2000; 74:133-7.
Sumi CD, Yang BW, Yeo IC, Hahm YT. Antimicrobial peptides of the genus Bacillus: a new era for antibiotics. Can J Microbiol 2015; 61: 93-103.
Brogden KA. Antimicrobial peptides: pore formers or metabolic inhibitors in bacteria? Nat Rev Microbiol 2005; 3: 238-50.
Sang Y, Blecha F. Antimicrobial peptides and bacteriocins: alternatives to traditional antibiotics. Anim Health Res Rev 2008; 9: 227-35.
Benitez LB, Velho RV, Lisboa MP, Medina LF, Brandelli A. Isolation and characterization of antifungal peptides produced by Bacillus amyloliquefaciens LBM5006. J Microbiol 2010; 48: 791-7.
Caldeira AT, Feio SS, Arteiro JM, Coelho AV, Roseiro JC. Environmental dynamics of Bacillus amyloliquefaciens CCMI 1051 antifungal activity under different nitrogen patterns. J Appl Microbiol 2008; 104: 808-16.
Lisboa MP, Bonatto D, Bizani D, Henriques JA, Brandelli A. Characterization of a bacteriocin-like substance produced by Bacillus amyloliquefaciens isolated from the Brazilian Atlantic forest. Int Microbiol 2006; 9: 111-8.
Potisap C. A metagenomics approach to understand the biological factors affecting in the presence of Burkholderia pseudomallei in the soil [Ph.D. Thesis in Medical Biochemistry and Molecular Biology]. Khon Kean: The Graduate School, Khon Kean University; 2014.
MacNeil I, Tiong C, Minor C, August P, Grossman T, Loiacono K, et al. Expression and isolation of antimicrobial small molecules from soil DNA libraries. J Mol Microb Biotechnol 2001; 3: 301-8.
Felczykowska A, Dydecka A, Bohdanowicz M, Gąsior T, Soboň M, Kobos J, et al. The use of fosmid metagenomic libraries in preliminary screening for various biological activities. Microb Cell Fact 2014; 13: 1.
Anderson DG, McKay LL. Simple and rapid method for isolating large plasmid DNA from lactic streptococci. Appl Environ Microbiol 1983; 46: 549-52.
Wilson K. Preparation of genomic DNA from bacteria. In: Ausubel FM, Brent R, editors. Current protocols in molecular biology. New York: Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, 1990: 241-5.
Sambrook J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed. New Yok: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
Green MR, Sambrook J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 4th ed. New York: Cold Spring Harbour Laboratory Press, 2012.
Clarke L, Carbon J. A colony bank containing synthetic CoI EI hybrid plasmids representative of the entire E. coli genome. Cell 1976; 9: 91-9.
Chen XH, Koumoutsi A, Scholz R, Eisenreich A, Schneider K, Heinemeyer I, et al. Comparative analysis of the complete genome sequence of the plant growth-promoting bacterium Bacillus amyloliquefaciens FZB42. Nat Biotechnol 2007; 25: 1007-14.
Niazi A, Manzoor S, Asari S, Bejai S, Meijer J, Bongcam-Rudloff E. Genome analysis of Bacillus amyloliquefaciens Subsp. plantarum UCMB5113: a rhizobacterium that improves plant growth and stress management. PLoS One 2014; 9: e104651.
Zhang G, Deng A, Xu Q, Liang Y, Chen N, Wen T. Complete genome sequence of Bacillus amyloliquefaciens TA208, a strain for industrial production of guanosine and ribavirin. J Bacteriol 2011; 193: 3142-3.
Daniel R. The metagenomics of soil. Nat Rev Microbiol 2005; 3: 470-8.
Hu HQ, Li XS, He H. Characterization of an antimicrobial material from a newly isolated Bacillus amyloliquefaciens from mangrove for biocontrol of Capsicum bacterial wilt. Biological Control 2010; 54: 359-65.
Aakvik T. New broad-host-range Biological Tools for Metagenomics and Screening of Marine DNA Libraries [Ph.D. Thesis in Biotechnology]. NTNU-Trondheim: Norwegian University of Science and Technology; 2011.
Sophie B, Portetelle D. Bacillus subtilis as a tool for screening soil metagenomic libraries for antimicrobial activities. J Microbiol Biotechnol 2013; 23: 850-5.
